As missões e os fortes desempenharam papéis importantes no Vale do Amazonas quanto à expansão territorial e a consequente colonização. Contribuíram para fixar marcos da penetração portuguesa naquele território disputado por outros povos.
Sempre de sentinela nas lonjuras do Vale estavam os fortes, instalados ao longo do século XVII: eram unidades pequenas, com poucos homens e escassas peças de artilharia. Isso, entretanto, não era empecilho para que enfrentassem os ataques frequentes de estrangeiros ou de nativos.
Em 1669 ergueu-se o Forte de São José do Rio Negro, evitando que espanhóis descessem pelo Rio Amazonas. Os fortes do Paru e Macapá, fundados em 1685, visavam impedir a passagem dos franceses da Guiana.
As ordens religiosas chegaram em épocas diferentes à região. Por exemplo: os carmelitas, em 1627, e os jesuítas, em 1636. Deparavam-se, porém, com os mesmos obstáculos, como a competição entre os colonos e entre as próprias ordens religiosas pelo "direito de administrar o indígena", visto tanto como mão de obra quanto como fiel servo de Deus.
A disputa acirrada entre as ordens exigiu a intervenção governamental. Na tentativa de resolver essa contenda, que envolvia também a ocupação do Vale Amazônico, inúmeras Cartas Régias fixaram as áreas de atuação das ordens. Os franciscanos de Santo Antônio receberam as missões do Cabo do Norte, Marajó e Norte do Rio Amazonas; à Companhia de Jesus couberam as dos rios Tocantins, Xingu, Tapajós e Madeira; os franciscanos ficaram com as da Piedade e do Baixo Amazonas, tendo como centro Gurupá; os mercedários, com as do Urubu, Anibá, Uatumã e trechos do Baixo Amazonas; e os carmelitas, com as dos rios Negro, Branco e Solimões. Nos anos finais do século XVII, as missões religiosas cobriam grande parte do espaço que viria a constituir a atual região amazônica brasileira.
O papel do indígena na ocupação do Vale do Amazonas era de extrema importância. Não se dava um passo sem ele, pois conhecia o território, sabendo se movimentar naquela área desconhecida pelo europeu. Os nativos eram os guias pela floresta ou pelos rios. Canoeiros, conduziam as embarcações nas longas expedições fortemente escoltadas, em meio a milhares de quilômetros, pelos cursos emaranhados d'água. Eram também caçadores, identificando a variada fauna, e coletores das "drogas do sertão", pois conheciam como ninguém a flora local.
A coleta se organizou no Vale sob a coordenação dos missionários. Os padres, que monopolizavam o trabalho indígena, usavam um artifício para que os nativos extraíssem elementos da flora em grande quantidade. Alegavam que, além das partes destinadas aos adultos, aos velhos e às crianças, deveriam extrair outra, destinada a Tupã. Esta fração – "Tupã baê" – acumulada nos depósitos das missões era, posteriormente, exportada para a Europa, onde seria comercializada com grande lucro.
Conduzido pelos nativos, o "homem branco" penetrava pelo coração pulsante da mata espessa, formada por imenso e heterogêneo verde, onde não bastava querer para efetivamente ocupar. Era uma tarefa complexa, em meio a terrenos submetidos a chuvas constantes, que provocavam um aumento no nível das águas, que, por sua vez, arrastavam e deslocavam grandes porções de terra próximas aos cursos dos rios. Por conta disso, a exploração detinha-se no que a floresta oferecia e possibilitava espontaneamente.
