Nos anos 60 do século XIX, uma nova crise na região do Prata se transformaria no longo e sangrento conflito conhecido como a Guerra do Paraguai. Esse episódio, durante algum tempo, foi entendido pelo lado brasileiro como uma luta realizada contra o ditador Solano López e seus planos expansionistas.
Mais adiante, na década de 1960, segundo a versão de historiadores como o argentino León Pomer, a razão da guerra seria relacionada aos interesses ingleses, que viam com desagrado a crescente autonomia paraguaia. Assim, havia uma emergente necessidade, por parte do governo inglês, de desarticular o Paraguai, mantendo o controle econômico sobre a América Latina.
Recentemente, a historiografia passou a concentrar-se mais atentamente na situação de cada país envolvido no conflito, bem como nas relações que mantinham entre si, sem, entretanto, negar a significativa influência do capitalismo inglês, naquela época, na América Latina. De acordo com essa linha historiográfica, formara-se uma zona de disputas e discórdias em torno dos rios Paraguai e Uruguai que remonta à época das Américas portuguesa e espanhola. As tensões prosseguiram com outros contornos no decorrer do tempo. Com o término da dominação espanhola, no início do século XIX, surgiram na região do Vice-Reinado do Prata, após muitas lutas, o Uruguai, o Paraguai, a Bolívia e a Argentina.
Nesse período coexistiram na Argentina correntes políticas divergentes. Uma delas era composta pelos comerciantes de Buenos Aires, que defendiam um Estado centralizado e unitário, pois, pelo Porto de Buenos Aires, controlariam o comércio exterior e, consequentemente, as rendas dos tributos sobre as importações. A outra corrente era federalista, sendo composta pelos grandes proprietários rurais, pequenos industriais e um grupo de comerciantes mais voltados para o mercado interno. Defendiam, através do Estado descentralizado, que suas rendas não fossem submetidas aos tributos estabelecidos pela burguesia comercial de Buenos Aires.
O Uruguai, por sua vez, nascera em 1828, após conflitos que envolveram o Brasil, em uma área onde os ingleses tinham diversos interesses financeiros e comerciais. Disputando o poder político uruguaio, formaram-se duas facções: os blancos, grupo composto por proprietários rurais, e os colorados, ligados aos comerciantes, simpatizantes das ideias liberais.
Quanto à província do Paraguai, desde 1810 recusava-se a submeter-se à burguesia formada pelos comerciantes do Porto de Buenos Aires. Sua independência seria definida quando da designação para a presidência de Carlos Antonio López, em 1842. Aos poucos, o Paraguai procurava crescer vinculando-se ao mercado externo. Buscando romper o isolamento do país, Carlos Antonio López instalou linhas telegráficas, construiu estradas de ferro, modernizou a esquadra, estabeleceu fábricas de tecidos, papel, tinta e pólvora. Por volta de 1862, seu filho Francisco Solano López ascendeu ao poder, procurando novas alternativas para prosseguir no desenvolvimento do Paraguai.
O governo imperial do Brasil via com preocupação alguns aspectos desse quadro político traçado por seus vizinhos da América Latina. Temia, por exemplo, que a Argentina, transformada em uma República forte, fosse capaz de causar problemas junto à "inquieta" província do Rio Grande do Sul. Por outro lado, quanto ao Uruguai, a preocupação relacionava-se às medidas de repressão ao contrabando na fronteira, já que muitos gaúchos criadores de gado tinham interesses econômicos naquele país. O governo do Brasil chegou, inclusive, a promover acordos secretos com os colorados com os quais tinha interesses comuns. Comentava-se que alguns "acertos" teriam sido intermediados por Irineu Evangelista de Souza, o Barão de Mauá, proprietário de um banco no Uruguai.
Com o Paraguai, o Brasil volta e meia via-se envolvido em atritos e desentendimentos. Algumas divergências relacionavam-se às questões de fronteira e à vontade do Brasil em garantir o acesso a Mato Grosso pelo Rio Paraguai. Uma viagem por terra do Rio de Janeiro até Mato Grosso demorava, em média, quatro meses e meio. Já a ligação fluvial cobria o percurso em menos tempo.
No início da década de 60 do século XIX, uma sucessão de fatos definiria algumas posições e acirraria antigas rivalidades. Em 1863, o governo imperial, após inúmeros incidentes que envolveram a atuação do embaixador inglês e a ação da Marinha inglesa, que apreendera embarcações brasileiras e estava fundeada no Rio de Janeiro, rompeu relações diplomáticas com a Inglaterra. Isso distanciou a posição brasileira dos interesses ingleses, gerando um clima de "exaltação patriótica", no dizer de Boris Fausto.
Na Argentina reunificada, Bartolomeu Mitre foi eleito presidente. A política assumida pelo novo governante argentino, que agradou ao Gabinete do Brasil – conduzido nesse momento pelos liberais –, incluía a aproximação com os colorados uruguaios e, também, a defesa da livre navegação nos rios da Bacia do Prata. Solano López, por sua vez, aliou-se aos blancos, então no poder no Uruguai, e aos adversários de Mitre na Argentina.
Segundo a historiadora Lilia Moritz Schwarcz, "o cenário da guerra estava montado e só faltava o estopim", que surge em setembro de 1864, quando uma esquadra comandada pelo almirante Tamandaré é enviada ao Uruguai, onde os blancos estavam no poder, para averiguar supostas violências praticadas contra brasileiros que lá moravam.
